新冠疫情的爆发对于全球的卫生系统都是一个巨大的挑战。对于病原携带者快速准确地进行识别至关重要。RT-PCR依然是目前检测2019-nCoV的金标准。但在大规模人口筛查中，面临诸多困难和挑战。
为了对民众进行大规模的筛查，各国都对核酸检测的方法进行了相应的改良。在涉及核酸检测的诸多环节中，如何对样本的混合数量，即样本池化（Sample Pooling）策略进行评估和优化，是大幅降低检测成本与时间的题中应有之义。
谁发明了混检？
这种将样本集中起来进行测试的方法，源自于美国哈佛大学统计学家、政治经济学家Robert Dorfman在20世纪40年代的创举。当时，Dorfman将这种方法用于对大规模人群进行梅毒、HIV、丙肝病毒等病原的筛查，并在之后的多年中不断进行改进。
Dorfman 在1943年发表的论文，其中详细叙述了运用样本池进行大规模病原筛查的方法和优势
Dorfman法最核心的要义是将数个样本合并为一个样本池进行一轮测试，如果均为阴性，则无需复测；如果有样本池呈阳性，那么将样本池中包含的每一个样本再进行第二轮单独复测。这种方法极大降低了病原检测的负担，缩短了检验周期，因此也被沿用至今。
天使和魔鬼站在天平的两端——混检样本池的策略制订
在疫情暴发的初期，有许多国家采用了基于Dorfman法的混检方式。
2020年3月，以色列的研究人员发表了一篇基于Dorfman法的2019-nCoV混样检测早期评估，并表示可以分别在2、4、8、16、32个混样中检测到单个2019-nCoV RNA样本。并且在当混样数量达到16时，灵敏度也没有受到显著影响，但当混合32个样本时，假阴性率估计为10%。随后，来自Alcoba-Florez等人报告，在5、10、15三组不同样本池大小的检测中，5个样本的池大小的灵敏度损失最小。同样，Farfan等人也认为在5个样本混合检测时，与单样测试时结果是一致的，没有显著的灵敏度损失。
由此，我们可以看出，在混合样本检测时，样本的混合数量是一个必须经过谨慎评估的数字。
作为医学检验工作者，我们都知道RT-PCR的基本原理，是特定序列引物与RNA（或退火的DNA单链）结合，并在聚合酶的作用下引导扩增，并以几何级数增长。形成的DNA双链再与特定的荧光探针结合，从而激发探针发光，再使用荧光定量装置评估测定荧光的亮度，从而反映出核酸扩增的倍数。底物拷贝数量越多，达到设定的判定阈值（Therehold）所需的循环次数（Ct值）就更少。
尽管混检可以极大地减轻检测工作量，并且保证检测结果的及时上报。但使用传统方法对样本进行混合时，无疑会对样本造成稀释，造成底物拷贝数量的减少。而即使是不降低拷贝浓度的采样方法，也会引入更多的非靶点核酸片段（例如人基因组DNA），对扩增造成干扰。当这个Ct值的判定区间变得相对固定时，就会造成灵敏度的显著降低，稍有不慎，就会造成漏检错检，当我们面对的是风险极高的传染性病原时，这种风险就显得更加难以承担——这也是为什么在前一段时间对涉嫌违法犯罪的几家医学检测机构中，「人为稀释样本」、「多管混检」等等字眼屡屡出现。
混合检测的天平两头，站着天使和魔鬼，评估者必须非常谨慎地评估这个平衡点在哪里，否则就有可能滑向混乱的深渊。
10 in 1 混采，中国的核酸检测策略科学吗？
由上面的研究我们可以知道，科学有效的群体病原筛查必须考虑各种因素。样本池的最佳大小、地区内的患病率、预期的灵敏度、可接受的误差率、检测试剂盒的局限性等等诸多要素都会对大规模筛查产生极大的影响。
我国在2020年8月发布了《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》，并且在目前的大规模常态化核酸检测中，也是最为主流的检测方式。
这种混检方式的核心内容基本遵循了Dorfman法，但是在一个核心问题上做了改进：不推荐对单采样本进行提取混合，而是将10个拭子一起放入含有6ml病毒保存液（VMT）的样本采集管中。这样一来，虽然一定程度上增加了信息登录的难度，但相比最严格的单管采样（1拭子/1ml VMT），仅仅将样本稀释了6倍。
考虑到中国目前对于新冠疫情的态度仍然是世界范围内最为谨慎的国家之一，国内卫生政策的主要目标是彻底消除本地感染，同时防止境外的病例输入，实现“动态清零”，这就使得错检、漏检不能够成为一种可以被轻描淡写地带过的问题，因此对于灵敏度的要求也更为严格。与此同时，在绝大多数中低风险地区中，患病率非常低，在触达每一个社区的网格化管理中锁定结果可疑的患者进行二次采样的成本也并不算高，所以中国还是采用了相对较为折衷的检测方法。
另一方面，在大多数西方国家，新冠疫情的大规模爆发已经成为既定事实，并且绝大多数国家缺乏能够统一管理、高效运转的行政机构和国家机器，这些国家的卫生政策相对宽松得多，进行检测的主要对象是识别患者和监测病情变化，而不是全面控制疫情。由于这些原因，以及商业等因素的考量，这些国家往往更注重检测的效率。
那么这种相对保守的检测策略，会不是会既跑了兔，也丢了鹰呢？
2021年，来自我国卫健委临床检验中心、北京医院等卫生机构的多位研究者，在《中华检验医学杂志》上发布了对于2019-nCoV混检对于检测结果影响的评估。研究者使不同浓度的样本液用来模拟不同病毒载量新冠肺炎患者的样本，再向不同浓度的采样管中放入1、5、10个健康人咽拭子，再使用不同的提取试剂盒和扩增试剂盒来评估不同混采数量对最终检测结果的影响。研究的主要结果如表1、表2：
表1 模拟不同混采倍数下使用a/b/c三种试剂盒进行提取对样本Ct值的影响
表2 模拟不同混采倍数下使用A/B两种试剂盒进行扩增对样本Ct值的影响
可以看到，不论使用何种提取试剂盒，不同大小的样本池N基因和ORF1ab基因的Ct值均依次升高，且差异有统计学意义，意味着混采确实会影响病毒核酸的提取效率。同时，在A试剂盒进行扩增的不同大小样本池下，Ct值也随混采数量增加而上升，即混采对于扩增也会同样造成干扰。
不过，我国在大规模核酸筛查方面也积累了极为丰富的经验。随着大量的样本数据不断积累，相关的判定标准也在不断更新。根据现行的《新冠病毒样本采集和检测技术指南》，对于阳性的结果判断已经不再局限于Ct值范围，而是加入了是否出现明显S形扩增曲线来进行判定，引用如下：
“
阴性:无Ct值、无S形扩增曲线；
阳性：Ct值小于等于检出限，且有S形扩增曲线，可报告为阳性；
灰区：Ct值位于灰区，建议重复实验，若重做Ct值仍处于灰区，但出现明显的S形扩增曲线，该样本判断为阳性，否则为阴性。
注：如使用商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。
”
这种不再拘泥于Ct值范围的判定方式，进一步保证了核酸检测的高灵敏度，减少错检漏检的假阴性率。尽管此前依然出现了检测机构假阴性的案例，但从目前来看，这种概率依然比较低，不会对疫情防控产生难以控制的影响。
不过，在上面提到的我国相关研究中，同样也指出在不同品牌试剂盒中，确实存在着提取效率、灵敏度等方面的明显差异。尤其是不同的PCR试剂盒，加样量、PCR程序等均存在着不同程度上的差异，产品声称的灵敏度从1000拷贝/ml到200拷贝/ml不等，也为不同机构在检测过程中增加了一定变数。正如本次研究的研究者在文中提到的：“混采样本检测前应评估混采模式下的分析灵敏度……核酸提取方法的适宜性，多拭子的核酸模板对扩增反应的影响等。”，且“试剂的提取性能是开展混采模式的关键因素”，研究者还建议，可以“使用加样量大、提取效率高的提取试剂，搭配检测灵敏度高的扩增试剂，方可保证混采样本的稳定检出，降低漏检风险”。
常态化核酸检测的当下，策略是否需要更新？
目前随着全国各地均在普及常态化核酸，构建“15分钟核酸圈”的背景下，国内的核酸检测需求依然保持在高位。
与此同时，相关的检测技术指导性文件也在不断更新。今年1月，在原有的10合1混采反馈良好的基础上，通过相关验证后，国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组印发了《新冠病毒核酸20合1混采检测技术规范》，将混样数量进一步扩大，采样浓度定为20拭子/11-12ml病毒保存液。虽然目前的主流混采方式依然是10：1的样本池，但也为未来进一步提高检测能力留出了空间和余地。
除了国内相关规范指南的更新，在新冠疫情波及全球近半数人口的当下，世界各国也都在积极探索更高效的检测策略，提出了更多基于或不基于Dorfman法的样本池化策略。
例如Ben-Ami等人提出的矩阵池策略。他们将n个样本组成一个n x n的矩阵，通过行与列的交叉点，可以直接识别出阳性样本，而不需要进一步的复测。Ben-Ami等人将8 x 8的矩阵池与1/8 Dorfman池进行比较，结论是Dorfman法在低患病率下的测试次数方面效率更高，而矩阵池则在地区患病率高于2%时体现出了更高的效率。
来自斯坦福大学的Sinnott-Armstrong以及甲骨文、谷歌等企业的年轻数学家们，则基于数学模型，提供了在不同患病率情况下进行矩阵池策略优化的数据支持。研究指出，通过特定的矩阵池策略（如图1），在2%和10%的患病率下，96孔板可获得最佳效率；而在大于10%的情况下，四孔合并（将四个相邻的孔合并为一个孔）效率会更高；而对于2%以下的患病率，384孔(16×24)板的性能最好。总体上来看，这种策略使得96孔板的测试任务量在2%的流行率下减少了四倍，在0.5%的流行率下减少了八倍。
图1 Sinnott-Armstrong等人提出的矩阵优化策略
此外，Deckert等人还在150000人口中模拟了一种「门到门」策略。其要旨是将关系密切的人群，例如家庭成员、同事等很有可能获得相同的结果的样本集中起来放入同一个池中。研究者认为，与单独测试相比，这种方法在150000人的筛查中减少了56%–93%的工作量。但这种方法对于前期流行病学调查的要求很高，也会带来新的额外工作。
除了上述的方法外，还有诸多研究者针对全球新冠浪潮提出了创新性的样本采样策略，然而这些策略都不是十全十美的，很多策略需要与本地的政策、国情、疫情严重程度等等相匹配，但依然拥有许多可以借鉴之处。（表3、表4）
表3 部分样本池策略的效率对比
表4 不同样本池大小的灵敏度差异
写在后面
无论是简单的Dorfman法，还是更加复杂的样本池策略，这些方法都被证实可以极大程度上提高检测能力。然而，决策者必须仔细考虑在增加群体规模和保持测试灵敏度、检测成本、流行病学现状、操作时间以及在复杂汇集期间升级污染风险之间的平衡，也正是因此，一种适用于所有实验室、所有地区的通用策略是不现实的。
6月7日，我国国家药监局发布了《关于进一步加强新冠病毒检测试剂质量安全监管工作的通知》，要求对新冠试剂盒实行“最严格监管”，以保障新冠试剂盒的性能能够胜任目前的核酸检测需求。
在当前形势下，10合1混采仍然被证明可以胜任我国目前的核酸检测需求。但随着疫情形势的不断变化，以及政策导向的调整，在核酸检测成本不断压缩、需求持续高企的将来，也许会出现更新、更高效的检测策略。
参考文献
[1] Dorfman R. The detection of defective members of large populations[J]. The Annals of Mathematical Statistics, 1943, 14(4): 436-440.
[2] 闫颖, 常乐, 姬慧敏, 等. 新型冠状病毒核酸混采对检测结果的影响[J] . 中华检验医学杂志, 2021, 44(5) : 388-393. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20201120-00845.
[3] Song Y, Wang X L, Xiao Y Q, et al. A review of pooled‐sample strategy: Does complexity lead to better performance?[J]. View, 2022: 20210005.
[4] 国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组. 新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范[S]. 2022
[5] 国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组. 新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）[S]. 2021
[6] Sinnott-Armstrong N, Klein D L, Hickey B. Evaluation of group testing for SARS-CoV-2 RNA[J]. MedRxiv, 2020.
[7] 国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组. 新冠病毒核酸20合1混采检测技术规范[S]. 2022
来源：医脉通
作者：薄奕
封面图及文中图片来源 | 视觉中国、NCBI、参考文献
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